Estudio y evaluación de la carcinogénesis

La carcinogénesis se estudia con varias pruebas toxicológicas estandarizadas. Una primera parte de estas pruebas se realiza in vitro y, si son positivas, se procede a una experimentación in vivo. Este enfoque experimental paso a paso se denomina ENFOQUE DEL PUNTO DE DECISIÓN, una secuencia de ensayos que se detiene al final de cada ensayo para decidir cómo proceder con el ensayo. Hay cinco etapas:

FASE A: estructura y características del compuesto cancerígeno;

FASEB: en esta fase de pruebas in vitro a corto plazo, se utilizan células de mamífero. Las células más utilizadas son los hepatocitos, porque se estudia el grado de reparación del daño que desarrolla el hepatocito según la gravedad del daño causado por la sustancia. En pocas palabras, no determinamos el daño per se, sino cuánto del sistema de reparación ha sido activado por la célula hepática.

El procedimiento implementado consiste en formar 3 cultivos de hepatocitos. En el primer cultivo los hepatocitos son sanos, en el segundo se tratan con la sustancia de ensayo y finalmente en el tercero se tratan con una sustancia de control que es ciertamente cancerígena.Estos tres cultivos contienen una base pirimidina radiactiva, que es timidina tritiada, que actúa como marcador.

Si el compuesto examinado provoca una mutación en el ADN, la célula responde a este problema activando los sistemas de reparación. Se corta la pieza de ADN que ha sufrido la mutación y gracias a la acción de la ADN polimerasa se reemplaza la pieza faltante por una nueva. Para la corrección, la ADNpolimerasa utiliza las nuevas bases, incluida la timidina tritiada. Se incorpora una base radiactiva. El análisis de radiactividad determina el nivel de mutación en las células tratadas: cuanto mayor es la radiactividad, mayores son las mutaciones del ADN.

También en la fase B también se realizan pruebas en bacterias, para poder estudiar si existen mutaciones inversas. Las bacterias utilizadas son las salmonelas que ya son portadoras de mutaciones. La mutación se refiere a la síntesis de histidina, por lo que las salmonelas no pueden crecer sin histidina. Estas colonias bacterianas se toman en parte para tratarlas con la sustancia de ensayo, en parte para el control negativo y en parte para el control positivo, y luego se analizan con un carcinógeno conocido. Si esta sustancia problema es un genotóxico indirecto, las enzimas metabolizadoras deben introducirse en el medio de cultivo. En este punto hay 3 cultivos que serán sembrados y cultivados en placas de Petri (no hay histidina en el medio de cultivo). Si no ha habido ninguna mutación por el carcinógeno a probar, en teoría no debería haber ninguna en las placas. . Si hubo una acción mutagénica del carcinógeno, puede haber cambiado la primera mutación y creado una segunda mutación capaz de hacer crecer la bacteria en el medio de cultivo libre de histidina. En este caso, la segunda mutación que modifica la primera mutación y Toma el nombre de RETROMUTACIÓN Por último, si se produce un crecimiento significativo en la piasta petri, el carcinógeno es directo.
Siempre con una prueba in vitro es posible determinar la integridad cromosómica. Esta prueba se realiza siempre en células de mamíferos y se utiliza para probar sustancias tóxicas capaces de provocar mutaciones en algunas enzimas responsables de la biosíntesis del ADN. Sustancia a analizar se somete a análisis in vitro Para poder determinar si la sustancia objeto de examen afecta a la integridad y al número de cromosomas presentes, se utiliza la prueba de micronúcleos. Los micronúcleos son vesículas que se forman con una parte de la cromatina en su interior. La cromatina incorporada en estos micronúcleos puede ser cromosomas completos o fragmentos de cromosomas. Los micronúcleos están formados por una división celular incorrecta dando lugar a células hijas con material genético no igualmente El resultado de esta prueba será la determinación de sustancias que se definen como venenos clastogénicos y del huso. La sustancia clastogénica produce micronúcleos con fragmentos acéntricos de cromosomas por lo que la sustancia induce una ruptura en los cromosomas, en cambio la sustancia venenosa del huso produce de los micronúcleos que en su interior están presentes cromosomas completos.
Si la sustancia analizada induce genotoxicidad en una o más pruebas, esta se define como altamente sospechosa, por lo que pasa directamente a la fase D. Si, por el contrario, la sustancia analizada no produce ningún efecto genotóxico, pasa a la fase de estudio. C porque puede ser un promotor.

FASEC: en esta fase se pueden realizar tanto ensayos in vitro como in vivo.

Para las pruebas in vitro se pudo demostrar la posibilidad de que la sustancia promotora rompa las uniones entre las células normales y las células tumorales, con el consiguiente paso de sustancias entre las dos células.

Una prueba in vivo es la inducción de tumores de piel en ratones. La sustancia a ensayar se aplica dos o tres veces a la semana en la piel del ratón. En 2/3 meses, si esta sustancia es un promotor, puede haber formaciones de papiloma. En ratones, se consideran dos datos principales: el número de ratones afectados por papilomas y el número de papilomas presentes en cada animal. Si la sustancia actúa como promotora y desarrolla un tumor en el ratón tratado, significa que efectivamente es una sustancia con efecto promotor.

Una vez que se completan estas pruebas, pasamos a pruebas in vivo a largo plazo.

FASED: en esta fase se ensayan todos los compuestos que resultan mutagénicos y todos los compuestos que no resultan mutagénicos. Las pruebas que se pueden realizar son diferentes, algunas de las cuales son pruebas realizadas en el hígado, en el pulmón y finalmente en la mama.

La prueba de hígado demuestra la formación no de un tumor recién formado, sino de un foco neoplásico, por lo tanto, algo que se está preparando para convertirse en un tumor. Las células de este foco ya son células atípicas, por lo que han sufrido una mutación y se están preparando para convertirse en células neoplásicas. Pasado un tiempo, gracias al examen de autopsia, se determina la formación de focos pre-neoplásicos, calculando el número y extensión de estas formaciones pre-neoplásicas.

La prueba pulmonar permite la determinación de un adenoma, que es una "anomalía de las células del tejido pulmonar. También en este caso, el tejido pulmonar de la rata se examina después de un tiempo bastante largo (meses) (estos adenomas son fácilmente identificables porque son nódulos blanquecinos en el epitelio pulmonar).
La prueba de mama permite la determinación de tumores en el tejido glandular. Siempre se evalúa el número de adenomas formados y el número de animales que presentan adenomas.

Si hay resultados positivos de estas pruebas, la sustancia de prueba es verdaderamente carcinógena. En este punto pasamos a realizar pruebas costosas con tiempos de ejecución muy largos.

FASEE: en esta fase un número variable de animales, de 20 a 50, son sometidos a pruebas de larga duración, estas pruebas son muy caras y tardan mucho en obtener ciertos resultados; hablamos de aproximadamente 1/8 de la vida del animal, es posible que durante el proceso de estas pruebas algunos animales mueran, pero siempre se estudian con autopsia y examen de tipo histológico. Los animales elegidos son siempre ratas y ratones y solo el 70-80% sobrevive hasta el final de las pruebas a largo plazo. Los animales utilizados son recién destetados, cuanto más jóvenes son, más sensibles son a los tratamientos. Durante el período de prueba a largo plazo, el investigador siempre cuenta con el apoyo de un matemático-estadístico, capaz de tener en cuenta toda la información recopilada y de reproducir los distintos datos.

Las dosis ensayadas en animales parten de la dosis máxima tolerada y todos sus submúltiplos, y se evalúa la reacción dosis-respuesta en el animal.
La administración debe acercarse siempre a la vía por la que el hombre puede entrar en contacto con la sustancia en examen, por lo tanto la vía oral, cutánea o respiratoria, mientras que si se prueba la carcinogenicidad de un fármaco también es útil realizar la administración intravenosa.
Los grupos de animales probados son 4 (50 animales por cada grupo):

Un grupo NAIF que no tiene tratamiento;
Un grupo tratado con el vehículo;
Un grupo tratado con la sustancia de prueba;
Un grupo tratado con un carcinógeno conocido.

Es muy importante que el número de animales en cada grupo sea lo más igual posible, de hecho, si hay demasiada diferencia en el número de animales, la prueba estadística puede resultar falsa.
Las evaluaciones que se realizan son:

Frecuencia total de tumores;
Frecuencia de algunos tumores;
Frecuencia de animales con más de un tipo de tumor;
Número de cánceres animales.

Al final de todas estas fases de estudio, la sustancia se clasifica en un ranking establecido por la IARC (Agencia Internacional para la Investigación y el Desarrollo sobre el Cáncer) y por la Agencia de Protección Ambiental (EPA).